PROTOKOL smear dan pewarnaan Bakteriologis

PROTOKOL   smear dan pewarnaan Bakteriologis 

Boedhy Rahardjo, Lab.Bakteriologi  DIII Analis Medis FK UNAIR

Bakteri, seperti kebanyakan sel, pada dasarnya transparan, dan harus dicat agar   mudah DILIHAT di bawah mikroskop. pertama Spesimen harus disebar di slide yang bersih (smear/sediaan) , dipanaskan/difiksasi, dan kemudian dicat dengan cat yang sesuai. Bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga cat yang bermuatan positif atau pewarna dasar akan terikat dan mewarnai mereka.

ALAT/BAHAN:

   slide bersih

   mikroskop

   sabun dan air panas

   aquadest dalam botol penetes

   Sampel/spesimen untuk dioleskan.  Spesimen dapat

   berupa: Buccal smear, gigi scrapings, yogurt,

   buttermilk,  ragi, tinja  smear, vaginal smear, satu

   koloni media biakan, dll

   bakteriologis loop (26 gauge Platinum )

   sumber api /lampu spirtus/bunzen

    pipet

   Cat: 0.3% methylene biru atau Hucker's Crystal Violet

            air ledeng

            kertas tissue atau kertas filter Whatman

 SIAPKAN   Smear:   

1. Ambil slide/obyek glass, harus   BERSIH, karena  smear tidak akan menyebar dengan baik jika slide   sedikit berminyak. Jika ragu, cuci slide dengan baik dengan sabun dan air, keringkan dengan kertas filter/tissue   atau Kimwipe (jangan menggunakan tissue daur ulang sebab   terlalu banyak serat yang bisa menempel di atas slide).

 2. a. Jika spesimen padat: tempatkan setetes aquadest steril pada slide yang bersih. Ambil sedikit spesimen/koloni mikroorganisme dengan loop yang steril dan suspensikan di dalam air. Sebar dalam radius   1,8 cm.  Sediaan harus tampak sangat samar-samar.

2. b. Jika spesimen cair: tempatkan  setetes kecil sampel pada slide, sebar dalam radius 1,8 cm. Encerkan dengan setetes air jika masih terlihat agak keruh.

FIXASI Smear:          

 

3. Fixasi smear dengan   melewatkan smear di atas api. Jangan terlalu panas. Slide tidak boleh terlalu panas,. Anda hanya berusaha untuk mengeringkan sampel sehingga akan menempel pada slide dan tidak tercuci di dua langkah berikutnya.

CAT SMEAR yang sudah difiksasi     4. Tambahkan 1-2 tetes cat (misalnya, 0,3% methylene biru atau Hucker's Crystal Violet). Biarkan 1 menit (atau 30 detik untuk Hucker's Stain, cat yang lebih kuat).

5. Bilas dengan air keran selama beberapa detik sampai tidak ada lagi cat terlihat mengalir keluar.   Keringkan secara  hati-hati (jangan menggosok) dengan   kertas tissue putih bersih. (  gunakan kertas filter hisap jika kertas tissue bermasalah/berserat.)

PENGAMATAN

Memeriksa sediaan / Smear yang sudah dicat:

6. Gunakan lensa obyektif 10x untuk memeriksa smear dengan tujuan untuk menemukan suatu daerah yang tersebar baik dan tidak terlalu pekat tercat. Lihat sekilas dengan lensa obyektif 40x dengan tujuan untuk mengkonfirmasi sebaran smear yang baik, termasuk bagian yang tercat. Kemudian gunakan minyak immersi dengan lensa obyektif 100x,   tujuan untuk studi spesimen (ujung lensa harus tercelup dalam minyak sehingga tidak ada sekat udara antara smear dan lensa). Sesuaikan cahaya untuk memperoleh penerangan yang optimal.    

7. Jika anda tidak menyimpan slide, cuci dengan baik dalam air sabun panas,   keringkan dan simpan.

 Gram Stain, Cara dan Interpretasi.

 Alat/Bahan

Sediaan kering  

Kertas tissu atau kertas saring

Mikroskop

Reagen Pewarnaan Gram

Crystal violet

Gram's iodine

Aseton-alkohol decolorizer

Safranin

 

1. Beri label pada slide dengan selotipe

2. Letakkan slide pada rak pewarnaan dan tuangi dengan kristal violet selama 1 menit.

3. Bilas slide dengan air keran,  miringkan sedikit  untuk membilas semua cat dari slide

4. Dengan slide sedikit miring, tuangi  beberapa tetes yodium  pada slide. Tempatkan slide dengan posisi mendatar, lalu

    tuangi dengan yodium atau lugol selama 1 menit.

5. Bilas slide dengan air seperti pada langkah 3.

6. Dengan perlahan-lahan miringkan slide, lalu teteskan aseton-alkohol pada slide sampai warna menjadi biru pucat dan tak

    ada lagi warna kristal violet yang terbawa oleh aseton alkohol

7. Segera bilas dengan air.

8. Dalam posisi slide sedikit miring tetesi dengan safranin  untuk mengganti bilasan air kemudian

    baringkan slide  dan tusngi slide dengan safranin selama 30 detik.

9. Bilas safranin dari slide dengan air keran.  tekan slide secara lembut dengan tissue   untuk membuang kelebihan air.

10.Periksa sediaan dibawah mikroskop dengan pembesaran minyak immersi  

 Bagan dan Hasil Pewarnaan Gram

      

Organisme                                                       Hasil Pemeriksaan                                                                                sediaan

Staphylococcus aureus

E.coli

Basil Gram Positive 

Basil Gram positif dapat ditemukan dalam 4 bentuk (berdasar panjang dan lebar sel) yang signifikan secara klinis 

                                    Bacillus anthracis   Spora bacillus

_________________________________________________________________________________

Basil Gram Negative  

 

__________________________________________________________________________________

Kokus Gram positive 

Kelompok  bakteri kokus Gram positip dalam berbagai variasi bentuk   

 

 

 ______________________________________________________________________________

Kokus Gram Negative  

Diplococci. Tidak membentuk rantai atau kluster 

           

________________________________________________________________________________

Yeast, Gram Positive

Dapat ditemukan dalam bentuk ‘budding’ dan/atau hyfa bercabang 

______________________________________________________________________________

Artefak

Presipitasi Crystal violet dalam sel epithelial  :                                Presipitasi Crystal violet pada Pewarnaan Gram  

Sering disangka sebagai kokus Gram positif                                  mirip basil Gram positif

        

_______________________________________________________________________________

Underdecolorization                                                               Overdecolorization

Neutrophils seharusnya berwarna pink, jika tahap                                        Bagian dari slide (area pink) akibat dekolorisasi

dekolorisasi dengan acetone alcohol kurang akan berwarna ungu             acetone alcohol yang berlebihan,

                                                               underdecolorized neutrophils       memberikan hasil palsu dari basil  Gram negative.

         

________________________________________________________________________________

Melaporkan Hasil Pewarnaan Gram

Tuliskan laporan pewarnaan Gram secara sistematis, Contoh, Seperti gambar di bawah, dilaporkan seperti berikut: Ditemukan bakteri kokus Gram positip dansel-sel radang PMN.

.

Review Pertanyaan

Apa tujuan pewarnaan bakteri?

Jelaskan tiga bentuk dasar bakteri.

Apa perbedaan antara pengecatan sederhana   dan pengecatan diferensial?

Apa perbedaan yang paling umum digunakan dalam pengecatan mikrobiologi  ?

Apa dasar   Pewarnaan Gram antara berbagai bakteri?

Daftar reagen yang digunakan dalam Pewarnaan Gram dan menceritakan fungsi masing-masing.

Jika mereka telah dicat Gram, dan tampak seperti hasil dibawa ini, bagaimana menuliskan laporan yang tepat?

Ungu (biru), sel-sel bulat                         :

Pink (merah), sel berbentuk batang          :

Pink (merah), sel-sel bulat                       :

Ungu (biru), sel-sel berbentuk batang :  

The Acid-Fast Stain

PENGECATAN TAHAN ASAM

Boedhy Rahardjo, Lab. Bakteriologi DIII Analis Medis-FK UNAIR

Pengecatan Tahan Asam adalah suatu teknik yang membedakan spesies Mycobacterium dari bakteri lain. Nocardia spesies juga bisa dikategorikan sebagai mikroorganisme  "Tahan-Asam."

Organisme Tahan Asam sukar dicat dengan pewarnaan biasa termasuk pewarnaan Gram . Aplikasi pewarnaan Tahan Asam untuk Mycobacterium dapat menggunakan metode Ziehl-Neelson (dengan pemanasan) atau metode Kinyoun (menggunakan pelarut lipid, tanpa pemanasan). Sekali tercat, Basil Tahan Asam mampu mempertahankan cat, sedangkan bakteri lain yang tidak tahan asam, cat lebih mudah hilang setelah dilunturkan dengan asam-alkohol.  Ciri inilah sehingga mereka disebut   sebagai "Tahan Asam".  Kandungan lemak tinggi dari dinding sel Mycobacterium mungkin yang bertanggung jawab terhadap sifat Tahan Asam yang dimilikinya.

Dalam Ziehl-Neelson klasik teknik pengecatan tahan asam  dilakukan seperti berikut: sediaan/smear dituangi pewarna  carbol-fuchsin, dipanaskan, dilunturkan/decolorized, terakhir dituangi counterstained     (methylene biru).    Organisme yang Tahan Asam akan berwarna merah karena dapat mempertahankan pewarna   carbol-fuchsin sedangkan latar belakang dan setiap  organisme yang tidak tahan asam   akan berwarna  biru karena methylene biru  ( counterstain). Metode Kinyoun   serupa dengan  metode Ziehl-Neelson tetapi tidak memerlukan pemanasan karena menggunakan pewarna carbol fuchsin dengan konsentrasi yang lebih tinggi 

Metode ketiga pengecatan Tahan Asam   adalah pengecatan fluorochrome   yang menggunakan auramine, suatu fluorescent dye. Pengecatan ini menggunakan prinsip yang sama seperti di atas   tetapi memerlukan  mikroskop fluorescent untuk bisa melihat hasilnya.

Bagan Proses Pengecatan Tahan Asam  :

Keterangan :

Carbolfuchsin adalah warna utama ( primary stain ).

Organisme yang Tahan Asam tahan terhadap pelunturan (  decolorization ) dengan acid alcohol.

Sesudah decolorization, tuangkan methyelene blue sebagai  warna pembanding (counterstain) untuk memberikan warna pada organisme ataupun material yang tidak tahan asam.  

Prosedur Metode Ziehl Neelsen  :

1. Tuangi sediaan/smear dengan cat carbolfuchsin, steam di atas air panas/mendidih selama 8 menit.

    Tambahkan cat jika diperlukan supaya jangan sampai mendidih

2. Sesudah didinginkan, lakukan decolorisasi dengan menambahkan acid-alkohol selama 15 – 20 detik

3. Bilas dengan air, untuk menghentikan proses decolorisasi  

4. Tambahkan counterstain (methylen blue) selama 30 detik

5. Bilas dengan air untuk menghilangkan  methylen blue

6. Keringkan sediaan dengan menggunakan kertas hisap, periksa di bawah mikroskop dengan

    menggunakan minyak immersi

Hasil Pengecatan 

Organisme Tahan Asam berwarna merah.

Organisme tidak Tahan Asam dan sel-sel

jaringan berwarna biru                                                  Cryptosporidium